Una nueva investigación mejora la precisión de la cuantificación molecular en la secuenciación de alto rendimiento

Un equipo en Oxford Departamento de Ortopedia, Reumatología y Ciencias Musculoesqueléticas de Nuffield (NDORMS) ha desarrollado un nuevo enfoque para mejorar significativamente la precisión de la secuenciación de ARN. Identifican la fuente principal de cuantificación inexacta en lecturas cortas y largas secuenciación de ARN. Han introducido el concepto de corrección de errores por «voto mayoritario», lo que ha dado lugar a una mejora sustancial en el recuento molecular de ARN.

Figura 1: Un esquema que muestra la corrección del error de voto mayoritario del homotrímero UMI. Construimos UMI con bloques de nucleótidos homotriméricos (compuestos por combinaciones de AAA, CCC, GGG, TTT). Al evaluar la similitud de los nucleótidos trímeros, se identifican y corrigen errores de eliminación, inserción o sustitución mediante un sistema de «voto mayoritario», seleccionando el nucleótido más frecuente.

La secuenciación precisa del material genético es crucial en la biología moderna, particularmente para comprender y abordar enfermedades relacionadas con anomalías genéticas. Sin embargo, las metodologías actuales encuentran limitaciones sustanciales. en un estudio históricoun consorcio internacional de investigadores, liderado por Adam Cribbs, profesor asociado de biología computacionaly Sol de JianfengInvestigador asociado postdoctoral en el Instituto Botnar, Universidad de Oxford, han desarrollado un método innovador para corregir errores en la amplificación por PCR, una técnica ampliamente utilizada en la secuenciación de alto rendimiento. Al identificar los artefactos de la PCR como la principal fuente de cuantificación inexacta, la investigación, publicada en Métodos de la naturalezaaborda un desafío de larga data en la generación de recuentos absolutos precisos de moléculas de ARN, lo cual es crucial para diversas aplicaciones en la investigación genómica.

Los investigadores se centraron en los identificadores moleculares únicos (UMI), que son secuencias aleatorias de oligonucleótidos que se utilizan para eliminar los sesgos introducidos durante la amplificación por PCR. Si bien los UMI se han adoptado ampliamente en los métodos de secuenciación, el estudio revela que los errores de la PCR pueden socavar la precisión de la cuantificación molecular, particularmente en diferentes plataformas de secuenciación.

jianfeng explicó: ‘La amplificación por PCR, esencial para la mayoría de las técnicas de secuenciación de ARN, puede introducir errores y comprometer la integridad de los datos. Abordamos este problema sintetizando códigos de barras UMI utilizando bloques de nucleótidos homotrímeros, mejorando la corrección de errores y permitiendo una cuantificación casi absoluta de moléculas de ARN, mejorando notablemente la precisión del recuento molecular».

Los homotrímeros son secuencias de nucleótidos que constan de tres bases idénticas, por ejemplo AAA, CCC, GGG. Al evaluar la similitud de nucleótidos de los homotrímeros, los errores se detectan y corrigen mediante un método de «voto mayoritario» (Figura 1).

El estudio demuestra que los UMI homotrímeros superan significativamente a los UMI monómeros tradicionales en la reducción del enriquecimiento de pliegues falsos positivos al analizar genes y transcripciones expresados ​​diferencialmente (DEG y DET). Esta mejora es vital para identificar y cuantificar con precisión DEG o DET, particularmente en enfoques de secuenciación masiva. Además, en la secuenciación unicelular, donde a menudo se requiere una amplia amplificación por PCR, los UMI homotrímeros han demostrado ser eficaces para mitigar los efectos de los artefactos de la PCR, mejorando así sustancialmente la confiabilidad de los datos de secuenciación.

«Al construir UMI a partir de bloques homogéneos de nucleósidos, nuestro objetivo era mejorar la corrección de errores en la secuenciación de lecturas cortas y largas, lo que demuestra nuestro compromiso de mejorar las aplicaciones de la tecnología de secuenciación», afirma Profesor asociado Adam Cribbsautor principal del artículo y líder del grupo en biología computacional.

Esta investigación tiene profundas implicaciones. Al rectificar los errores de PCR en los UMI, se aumenta enormemente la precisión de la cuantificación molecular en diversas aplicaciones de secuenciación. Es una herramienta vital para los investigadores en secuenciación de ARN a granel, ARN unicelular y ADN, lo que permite análisis precisos de expresión genética y perfiles moleculares. La corrección de errores UMI mejorada reduce la incidencia de falsos positivos y ofrece múltiples aplicaciones de diagnóstico, especialmente en escenarios que requieren un análisis longitudinal de muestras.

Fuente: Universidad de Oxford